借助PreSens SensorPlugs实时监测大肠杆菌培养的O2、pH和CO2水平

本研究旨在评估PreSens SensorPlugs在微流体生物反应器（MB）中监测细菌培养的有效性，尤其是在培育肉生物工艺中防止潜在污染的重要性。大肠杆菌（ATCC 25922）在配备集成SensorPlugs的定制微流体反应器中进行培养。光学测量清晰显示大肠杆菌的生长过程，使我们能够实时评估培养状况。

细胞培养基是培育肉生产中的主要成本因素，因此，通过传感器提供的额外监测功能优化生物反应器设计，将有助于降低成本并*大化每单位培养基体积的细胞产量。传统生物工艺中放大的问题通常依赖于按比例缩小的方法，而小型化生物反应器在早期工艺开发中获取工艺相关数据的作用愈加重要。我们在开发新一代低成本传感器时采用“实验室在芯片上”（LoC）方法，以监测细胞培养基中的多种参数，如生物量、氨和谷氨酰胺。

本研究使用定制的微流体生物反应器，结合阻抗传感器、光学传感器及PreSens提供的O2、CO2和pH传感器插头。项目的核心目标是确定微流控生物反应器内部过程，并量化其对细胞行为、活力与试剂有效性的影响。此外，我们还测试了PreSens SensorPlugs在细菌与哺乳动物细胞培养监测中的表现，并进行了人类唾液的试点实验，探索传感器在评估培育肉*终产品风味方面的潜在应用。这些研究结果展示了我们在细菌培养监测上的显著进展。

### 材料与方法
多层MB芯片由透明且生物相容的材料（玻璃和PMMA）制造。顶层和中间层均为PMMA，而互连层则采用3M双面胶带（3M -020F，圣保罗，明尼苏达州）。用于细胞培养的底层为玻璃，阻抗传感器通过Agfa-Gevaert NV的纳米银墨水及15% Ag纳米颗粒与导电墨水打印，使用压电控制喷墨打印机Fuji Dimatix DMP-3000完成。传感器表面覆盖一层薄薄的SU-8 3000 Microchem光刻胶。顶层设有入口/出口孔以便移液样品，并开设三个直径为2.1 mm的孔用于安装PreSens SensorPlugs，确保传感器与样品直接接触，实现实时参数测量。芯片中间层的储液槽样品体积为1.8 mm。我们在胰蛋白胨大豆肉汤中接种细菌，制备出大肠杆菌的过夜培养物，并随后制备浓度为0.5 McFarlan的大肠杆菌培养物（1.5 x 10^6 CFU/mL），用于MB培养。整个培养过程在37 °C的微生物培养箱中进行（见图1）。 图 1：大肠杆菌培养的实验装置。将 PreSens 仪表和电子元件放置在微生物培养箱内。

### O2、CO2和pH值的监测
如图2所示，O2、CO2和大肠杆菌培养过程中pH值的测量数据显示了预期结果。在培养大肠杆菌的3小时内，pH值测量（图2a）在初始滞后阶段结束后显示细菌进入指数生长期，其倍增率即生成时间。实验室条件下，大肠杆菌的生成时间范围约为15-40分钟。因此，在实验开始和结束时，我们用血细胞计数器测定了大肠杆菌的浓度。图3展示了血细胞计数器的放大部分，计算细胞单位总数并得出平均值，从而确定芯片上的总体浓度。细菌计数采用光学显微镜进行，结果显示细菌数量增加近13倍。 在t=0分钟时，初始pH值约为7.3。三小时后，观察到细菌培养物酸化（pH ~ 6.8）和CO2百分比增加，同时O2含量下降。图表展示了大肠杆菌生长的预期特征过程。在一个滞后生长期（~1.5小时）内，pH和CO2没有显著变化，此时氧气被消耗。约1.5小时后，CO2水平迅速上升，O2含量下降，指示TBS培养基被细菌消耗，细胞进入对数生长期。随着细胞数量增加，氧气含量逐渐降低，并在实验期间降至零。这一点也反映在CO2的增加上，因氧气不足，大肠杆菌无法继续生长，进入稳定相。3小时后，O2水平降至3%，而CO2升至4%。微生物培养监测传感器提供了全面的结果，使我们能够精确评估当前的培养状态。